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谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B C10H17N3O6S

  • 型   號:生化試劑分離試劑
  • 價   格:
  • 更新時間:2024-09-02
  • 廠家性質(zhì):經(jīng)銷商

谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B C10H17N3O6S
特性: 粒度:45-165µm 流速:75cm/h 工作PH:4-10 耐壓:0.3Mpa 載量:>5mg 谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶

谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠 4B C10H17N3O6S 

pGEX載體表達的外源蛋白與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合,因此可以通過谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進行純化。GSTs是一類以谷胱甘肽(γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸)作為底物,通過形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST對底物的親和力是亞毫摩爾級的,因此谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對GST及其融合蛋白的純化效率很高??梢杂煤坞x谷胱甘肽的緩沖液洗脫結(jié)合GST融合蛋白。樹脂用3mol/L NaCl的緩沖液再生。谷胱甘肽瓊脂糖對GST融合蛋白的結(jié)合能力很強(每毫升柱床體積的樹脂能結(jié)合8毫克融合蛋白)。

特性:    粒度:45-165µm                        流速:75cm/h               工作PH:4-10                        耐壓:0.3Mpa    載量:>5mg 谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶

使用說明:

谷胱甘肽樹脂的處理:

1.輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的容器,將樹脂混成勻漿。

2.取部分勻漿放入15mL聚丙烯管(每100mL 細(xì)菌培養(yǎng)物大約需要2mL 勻漿)。

3.4℃ 500 g離心5分鐘,小心去掉上清。

4.在樹脂中加入10倍柱床體積預(yù)冷的PBS,顛倒數(shù)次混勻,4℃ 500 g離心5分鐘,小心去掉上清。

5.每毫升樹脂加入1毫升冷的PBS,制成50%勻漿,顛倒數(shù)次,混合均勻,懸液冰上放置待用。制備細(xì)胞抽提物:

6.每100毫升培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀重懸于4mL PBS緩沖液中。

7.加入溶菌酶至終濃度為1mg/mL,冰上放置30分鐘。

8.用針筒將10mL 濃度為0.2%的TritonX-100 強行注入黏稠的細(xì)胞裂解物中,劇烈振動數(shù)次混勻。加入DNase和RNase至終濃度5ug/mL, 4℃振動溫育10分鐘,4℃ 3000 g離心30分鐘,去除不溶性細(xì)胞碎片,上清轉(zhuǎn)移到一只新管中,加入DTT至終濃度1mmol/L。純化融合蛋白:

9.細(xì)胞裂解物與適量50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混和,每100毫升細(xì)菌培養(yǎng)物加2mL樹脂,于室溫輕搖30min。

10.混合物于4℃以500 g離心5分鐘,小心去掉上清并留樣少許進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

11.沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS,顛倒離心管數(shù)次混勻,洗去未與樹脂結(jié)合的蛋白。

12.4℃以500 g離心5分鐘,小心去掉上清并留樣少許進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

13.重復(fù)步驟11和12兩次。

14.結(jié)合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫液洗脫,也可用凝血酶、腸激酶或Xa 因子切割,釋放靶蛋白。

用谷胱甘肽洗脫融合蛋白:

15.沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液,室溫輕輕攪動10min,洗脫樹脂上結(jié)合的蛋白。

16.4℃以500 g離心5分鐘,上清(含洗脫的融合蛋白)移至新管中。

17.重復(fù)步驟a和b兩次,合并3次上清。蛋白酶解從結(jié)合的GST融合蛋白上回收靶蛋白:

18.在結(jié)合了融合蛋白的樹脂中加入凝血酶、腸激酶或Xa 因子(根據(jù)融合蛋白中的位點選擇),每mL樹脂加入50單位溶于1mLPBS的蛋白酶。顛倒離心管數(shù)次混勻,室溫下振蕩2—16小時。用小規(guī)模實驗確定精確時間。

19.4℃以500 g離心5分鐘,上清小心移至新管中。(GST仍結(jié)合在樹脂上,而靶蛋白在上清中,蛋白酶也在上清中,仍需要分離)

20.10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每一步樣品的蛋白質(zhì)組成。試劑配制:谷胱甘肽洗脫緩沖液:10mmol/L還原型谷胱甘肽,50mmol/L Tris-Cl (pH8.0)

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